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牛病毒性腹瀉病毒抗原即時檢測試劑盒的性能評價

[ 更新時間:2013-08-16 ]

 

牛病毒性腹瀉病毒抗原即時檢測試劑盒的性能評價
羅海峰 葛艷華 Gu Hao—yi Anton Mestek Jr.翁立楠
Christian Schelp。Christoph Egli。Serge Leterme
1.北京愛德士元亨生物科技有限公司,北京101300;2.IDEXX Laboratories Inc.,Westbrook-Maine 04092;3.IDEXX Switzerland AG ,Liebefeld—Bern 3097
 
摘要   為了評價牛病毒性腹瀉病毒抗原即時檢測(BVDV Ag POC)試劑盒的性能,選擇E 蛋白、不同亞型的BVDV抗原陽性血清以及大量采集于牛場的全血、血漿和小耳組織樣本,用IDEXX的BVDV Ag ELISA和BVDV Ag POC同時進行檢測。結果表明:BVDV Ag POC可以有效檢測E一蛋白,且對于E 蛋白的稀釋靈敏度與EHSA方法一致;對于BVDV 1型和2型病毒都可以有效檢出;對824份全血樣本、587份血漿樣本以及400份小耳組織樣本的檢測結果顯示,所有持續感染牛均被檢出,靈敏度達到100%,特異性也超過99%;BVDVPOC與ELISA方法的符合性很好;該牛病毒性腹瀉病毒抗原即時檢測試劑盒可以實現不同類型牛場對于持續感染牛的快速檢測,作為一個有用的工具可以幫助牛場進行BVD的防控及清除。
關鍵詞 牛病毒性腹瀉病毒;即時檢測;靈敏度;特異性;性能;評價
牛病毒性腹瀉一黏膜病(bovine viral diar—rhea—mueosal disease,BVD—MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的主要發生于牛的一種急性、熱性傳染病,在臨床上引起一系列復雜的癥狀,主要包括牛的病毒性腹瀉、急慢性黏膜病、免疫耐受和持續性感染、免疫抑制、繁殖障礙、血小板減少和出血癥等,致病機理非常復雜,嚴重影響養牛業生產的各個環節。同時,牛病毒性腹瀉病毒是一種世界范圍廣泛分布的危害動物健康的重要病原體,它不僅感染牛,而且能夠感染豬、綿羊、山羊、鹿、駱駝及其它野生動物。
妊娠母牛感染非致細胞病理變化型BVDV后,此時胎兒的免疫系統尚未發育成熟,不能識別外來的BVDV,初生犢牛一旦成活,其臨診癥狀表現正常,血清學反應呈陰性,而此時犢牛則處于免疫耐受狀態,成為持續感染(Persistently infected,PI)者,持久帶毒、排毒,PI牛也就成為了BVDV在牛群中流行的傳染源 。有些P1牛會表現出黏膜病的癥狀(腹瀉、發育不良、久配不孕等),但是有些PI牛不表現任何癥狀,從而被當作正常牛只一直在牛群飼養圈,并使BVDV在牛群中傳播??梢妼τ贐VDV持續感染牛的檢測將有利于牛群生長發育。本文對于新近開發的牛病毒性腹瀉病毒抗原即時檢~(BVDV Ag POC)試劑盒的性能進行了評價,通過與酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行比較探索其用于檢測BVDV持續感染牛
的可行性。
1 材料與方法
1.1 材料
E m8 (gp48)蛋白由IDEXX Switzerland AG瑞士研發中心提供;不同亞型BVDV抗原陽性血清樣本由IDEXX Laboratories Inc.美國研發中心提供;BVDV Ag ELISA試劑盒及BVDV Ag POC試劑盒均來自于IDEXX Laboratories Inc.;全血樣本、血漿樣本以及小耳組織樣本來自于牛場。
1.2 方法
1)BVDV Ag ELISA檢測血清血漿的操作方法。血清血漿樣本直接加入到ELISA板內,按照產品說明書進行孵育和后續操作。設2孔陰性對照和2孔陽性對照,陽性對照平均值減去陰性對照平均值,其差必須大于或等于0.150;通過計算每個樣品與陰性對照平均值的差值(S-N)來判定BVDV抗原結果。如果(S-N)值小于或等于0.300,判為BVDV抗原陰性;如果S-N值大于0.300,判為BVDV抗原陽性。
2)BVDV Ag ELISA檢測小耳組織樣本的操作方法。對于小耳組織樣本首先采用耳組織浸泡液在室溫下浸泡12~24h后,混勻,取樣加入ELISA板內,按照產品說明書進行孵育和后續操作。設2孔陰性對照和2孔陽性對照,陽性對照平均值減去陰性對照平均值,其差必須大于或等于0.150;通過計算每個樣品與陰性對照平均值的差值(S-N))來判定BVDV抗原結果。如果S-N值小于或等于0.200,判為BVDV抗原陰性;如果S-N值小于或等于0.300
但大于0.200,判為可疑;如果S-N值大于0.300,判為BVDV抗原陽性。
3)BVDV持續感染牛的判定。對于第1次采樣檢測BVDV抗原陽性的牛只,在7~14d后再次進行采樣,并使用BVDV Ag ELISA進行檢測。如果再次檢測為BVDV抗原陽性,則該動物為BVDV持續感染牛;如果再次檢測結果為BVDV抗原陰性,則該動物不是BVDV持續感染牛。
4)BVDV Ag POC檢測全血、血清和血漿的操作方法。將檢測裝置放在平整的桌面上,使用提供的滴管滴將1滴樣本滴人檢測裝置的加樣孔中,lmin內滴加2滴緩沖液并且開始計時,15min后觀察結果;質控線位置呈現紅色條帶顯示試驗有效;檢測線的顏色強于背景結果,判為陽性;檢測線的顏色與背景顏色相同或弱于背景顏色,結果為陰性。
5)BVDV Ag POC檢測耳組織樣本的操作方法。耳組織樣本裝入樣品管中,然后滴加8滴(對于小耳組織樣本)或者16滴(對于大耳組織樣本)緩沖液,浸泡5min以上,徹底混勻后使用提供的滴管滴將1滴樣本滴人檢測裝置的加樣孔中,1min內滴加2滴緩沖液并且開始計時,15min后觀察結果。質控線位置呈現紅色條帶顯示試驗有效;檢測線的顏色強于背景顏色,判為陽性;檢測線的顏色與背景顏色相同或弱于背景,結果為陰性。
2 結果與分析
2.1 對于E 蛋白的檢測及稀釋靈敏度比較
對于采用基因工程表達的E一蛋白進行系列稀釋,并且采用BVDV Ag ELISA和BVDV Ag POC分別進行檢測,檢測結果見表1。
由表1可見,BVDV Ag POC可以有效檢測E ,并且對于Em8 的稀釋靈敏度與ELISA相同。
2.2 對于BVDV 1型和2型血清的檢測
使用BVDV Ag POC檢測2l份已知病毒亞型的BVDV Ag陽性血清,其中包含有13份BVDV 1
型血清和8份BVDV 2型血清,檢測結果見表2。
由表2可見,BVDV Ag POC可以有效檢測BVDV 1型和2型病毒。
2.3 對于全血樣本的檢測
自9個牛場收集824份全血樣本,采用BVDV Ag POC進行檢測,記錄結果。采用BVDV Ag
ELISA對于全血樣本分離得到的血漿進行檢測,對于陽性結果的牛只1周以后再次采血進行檢測,如果再次為陽性,則判定為持續感染(PI),并且記錄相應結果。將BVDV Ag POC檢測結果與BVDV AgELISA檢測的PI結果相比對,BVDVAg POC對于全血樣本檢測的靈敏度是100.0%,特異性為99.1%。
2.4 對于血漿樣本的檢測
自9個牛場收集587份血漿樣本,采用BVDVAg POC進行檢測,記錄結果;同時采用BVDV AgEUSA進行檢測,對于陽性結果的牛只1周以后再次采血進行檢測,如果再次為陽性,則判定為持續感染,并且記錄相應結果。將BVDV Ag POC檢測結果與BVDV Ag ELISA檢測的PI結果相比對,BVDVAg POC對于血漿樣本檢測的靈敏度是100.0%,特異性為99.4%。
2.5 對于耳組織樣本的檢測
自4個牛場收集400份小耳組織樣本,采用BVDV Ag POC進行檢測,記錄結果;同時進行BVDVAg ELISA檢測,對于陽性結果的牛只1周以后再次采樣檢測,如果再次為陽性,則判定為持續感染,并且記錄相應結果。將BVDV Ag POC檢測結果與BVDV Ag ELISA檢測的PI結果相比對, BVDVAg POC對于全血樣本檢測的靈敏度是100%,特異性為100%。
3 討論
目前OIE推薦的BVDV抗原檢測方法,也是國際貿易標準方法,包括病毒分離(Virus Isolation)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫組化(Immunohisto-chemistry)以及核酸檢測(Nucleic acid detection)~1。目前ELISA方法作為檢測牛病毒性腹瀉病毒的經典方法,已經被應用于多個國家的凈化計劃中,其特異性強、靈敏度和可靠性都很高。但是由于目前OIE推薦的4種方法均需要一定的實驗條件,并且試驗結果需要經過幾小時到幾天的時間才可獲得。因此開發一種靈敏度、特異性與ELISA方法相似,同時操作簡便、不需要特殊儀器的檢測方法,對于小型農場的疾病防控,以及在需要盡快獲得檢測結果的場合下使用,具有重大的優勢。牛病毒『生腹瀉病毒抗原即時檢測試劑盒采用膠體金技術,運用側向層析原理,可以在加入樣本后15min獲得結果,所有反應在室溫下即可完成,不需要任何其他儀器及特殊的實驗條件,完全達到快速檢測的要求,可以滿足各種環境下對于單一樣本快速檢測的需求。
PI牛的清除是牛場清除BVDV的重要目標,運用適當的檢測手段檢出這些PI牛,一定要在第一時間將它們隔離出群,并盡早淘汰。實驗結果表,BVDV Ag POC檢測標的物為E m8,E m8蛋白為檢測BVDV的重要靶蛋白,該試劑盒可以準確有效地檢測出樣本中BVDV的存在;對于1型和2型BVDV均可以檢測。對于824份全血樣本、587份血漿樣本以及400份小耳組織樣本的檢測顯示,所有的PI牛全被BVDV Ag POC檢測出,靈敏度達到100%,針對不同類型的樣品,BVDV Ag POC特異性略有不同,但都超過99%。該結果顯示BVDV Ag POC與ELISA方法具有極高的符合性,其性能可以滿足對于BVDV PI牛檢測的需求。
據文獻報道,對北京地區7個規?;膛龉?4028頭荷斯坦奶牛進行BVDV抗原檢測。共檢出PI牛58頭,其中成母牛9頭,后備牛49頭;場內陽性率0.04~1.02%t61。從河北省部分牛場采集1030殖與飼料2012份樣本進行BVDV抗原檢測,平均檢出率40.9%㈣??梢?,BVDV廣泛存在于國內的牛場中。參照瑞典凈化BVDV的經驗,明確牛只感染狀況,及時清除PI牛,同時控制引入的牛只,將有助于病毒的凈化。而BVDV Ag POC作為可以單一檢測的快速檢測試劑盒,可用于及時明確新生犢牛、引入牛只的BVDV感染狀況。同時歐洲的清除計劃也顯示出快速確定牛只感染狀況,也有利于清除病毒 。由此,牛病毒性腹瀉病毒抗原即時檢測試劑盒作為一個可以快速檢測樣品中BVDV抗原的試劑,可以成為牛場進行BVDV的防控及清除的有力工具。
                                  
本文內容摘自《養殖與飼料2012第11期》
 
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