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PPA—ELISA檢測試劑盒在豬瘟抗體臨床監測中的應用

[ 更新時間:2013-09-13 ]

 

PPA—ELISA檢測試劑盒在豬瘟抗體臨床監測中的應用
近年來,我國豬瘟的流行和發病特點發生了很大變化,轉變為隱性感染和亞臨床感染,臨床表現也更加復雜,既有區域性流行,又有零星散發,既有高死亡率的急性癥狀,又有持續感染的溫和性癥狀,出現了所謂“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟’’和“帶毒母豬綜合征”,病理剖檢也常常不同于典型豬瘟的病理變化,給獸醫臨床診斷帶來很大困難。盡管血清學抗體檢測方法很難有效區分疫苗毒與野毒產生的抗體,但由于其具有使用方便、一次檢測量大和血清容易保存等優點而被廣泛應用,在豬瘟流行狀態監測和流行病學調查等方面有著重要作用,也是免疫豬群抗體水平監測的主要方法,對疫苗免疫效果評價及免疫程序的制定均具有重要意。本研究應用豬瘟病毒PPA—ELISA抗體檢測試劑盒對436份免疫豬血清樣品進行檢測,旨在了解豬瘟的疫苗免疫效果,合理指導豬瘟的防疫,為豬瘟的綜合防控提供參考。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
2012年3一l2月山東濱州預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室采集山東、河南、河北等地免疫豬臨床血樣共436份,按常規方法分離血清并編號,-20℃保存備用。豬瘟病毒PPA—ELISA抗體檢測試劑盒121由本實驗室制備并保存。ELX800一酶標儀、37℃恒溫培養箱、8道移液器。
1.2 間接EUSA檢測步驟及結果判定
1)在A1和A2孔中分別加入試劑盒中的100 uL陰性對照血清;
2)在A3和A4孔中分別加入試劑盒中的100 L陽性對照血清;
3)將分離的臨床血清1:100稀釋后,取100 L加入相應孔中,并做好記錄;
4)37℃孵育1 h;
5)將各孔的廢液棄入廢液桶,將試劑盒內20x濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋成1 X洗滌液后每孔加入約300 L進行洗板,重復5次,每次2~3 min;
6)將試劑盒內lOx酶標抗體用蒸餾水稀釋成l×酶標抗體后,每孔加入100 L;
7)37℃孵育1 h;
8)重復步驟5);
9)每孔加入試劑盒中的底物溶液100 L;
10)室溫避光孵育5 min;
l1)每孔加入試劑盒中的終止液50 L;
12)在酶標儀的450 nm波長處測定各孔的吸光度值,即0D 值。當陰性對照血清的0D45o值≤0.2、陽性對照血清的0D45o值I>0.4時,試驗結果成立,記錄各檢測樣品的OD45o值,計算各檢測樣品的S/P值。當樣品S/P值≥0.282時判為陽性,當S/P值<0.231時判為陰性,當0.231≤S/P值<0.282時判為可疑。對可疑樣品須重新檢測,重檢時,S/P值I>0.231為陽性。
2 結果
本試驗陰性對照血清的0D45o值分別為0.105和0.107(取均值0.106),陽性對照血清的OD45o值分別為1.115和1.121(取均值1.118),符合陰性對照血清0D45o值≤0.2、陽性對照血清0D45o值>10.4的要求,試驗結果成立。根據S/P值計算公式,計算得到陽性樣品376份、陰性樣品35份、可疑樣品25份。對25份可疑樣品重新檢測,得到陽性樣品18份、陰性樣品7份。436份檢測樣品共計得到陽性樣品394份、陰性樣品42份,陽性率為90.4%(394/436)。
3 討論

      豬瘟的診斷方法很多,主要包括病毒的分離與鑒定、血清學方法及分子生物學檢測方法。其中,血清學方法是檢測豬瘟血清抗體的重要手段之一。ELISA診斷方法具有敏感性和特異性強、操作簡單、檢測快速、重復性好、高通量、無輻射、價格低廉等特點,在病毒學、免疫學、血清學、寄生蟲學、細菌學等領域得到了廣泛應用,是當前動物傳染病檢疫、流行病學調查和免疫監測廣泛采用的血清學診斷技術[21。因此,筆者選擇PPA—ELISA抗體檢測試劑盒對豬瘟免疫后的抗體水平進行監測,結果發現,豬瘟的平均抗體陽性率高達90.4%,遠遠高于我國農業部要求的豬瘟平均抗體陽性率75%的標準,說明我國現行豬瘟疫苗免疫效果較好,但仍存在個別豬場免疫失敗的現象。本試驗中抗體水平不達標的豬場收到檢測結果后,對免疫失敗豬及時重新免疫。本試驗結果顯示,豬瘟病毒PPA—ELISA抗體檢測試劑盒操作簡單、敏感、特異、檢測快速、高通量,非常適用于豬場免疫后的抗體水平監測。

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